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CNS前沿文献追踪ndashSI

来源:布拉柴维尔 时间:2020/9/16
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回头看看,关于DNA损伤修复的文章分享了好几篇,索性又扒了扒老文章,找到了一篇17年的nature子刊,看的是DNA损伤修复过程中的γH2AX,具体内容如下:

作者想研究DNA损伤修复过程中γH2AX,先用共聚焦和WB看了一下伴随修复过程γH2AX的变化趋势

看看损伤后不同时间点细胞周期、增殖情况

作者除了想用SIM超分辨观察外,还想用ChIP-seq,又验证了一下抗体和测序

准备工作做好之后,作者构建自己的方法:把SIM超分辨、ChIP-seq、数据库挖掘整合到一起,在纳米水平找到参与DNA损伤修复的结构单元

先用共聚焦和SIM(SIM原始数据可以转出宽场图片,对应pseudo-widefield;转出的宽场图片又可进行反卷积,对应+deconvolution)分别观察DNA损伤后不同时间细胞核内γH2AX蛋白点的数目,四种图片模式都反映出随修复进行γH2AX蛋白点先增多后减少的趋势,值得注意的是SIM宽场、SIM宽场反卷积、SIM计出的点数均比共聚焦多(光漂白、分辨率的限制造成了共聚焦计数偏低)

再看完随修复进行γH2AX点数的变化之后,又用SIM看了一下γH2AX蛋白点的尺寸

又拿分辨率更高的STED技术看了一下蛋白点的尺寸,发现STED测得的尺寸只比SIM测得的小了20%左右,验证了SIM超分辨的数据

再染γH2AX的同时,作者用DAPI还染了DNA,对γH2AX处DNA含量进行了测量,发现随修复进行,γH2AX处DNA含量先升高后降低

别忘了作者还计划了ChIP-seq,测序的数据观察到的DNA含量变化趋势和超分辨一致

ChIP-seq数据如果只看一个γH2AX包裹的DNA含量就亏了,作者将不同时间点的ChIP-seq数据和数据库放到一起,看损伤后不同时间点γH2AX在基因组上的分布情况,发现修复早期γH2AX主要分布在常染色质(以H3K36me3为marker),修复末期则分布到了异染色质(以H3K9me3为marker),暗示先修复常染色质再修复异染色质

ChIP-seq看到的γH2AX分布在SIM超分辨上验证一下,发现γH2AX的确是早期在常染色质上,末期在异染色质上

常染色质异染色质的DNA压缩程度不同,γH2AX随修复进行在常染色质、异染色质上分布的变化又让作者

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