CircularRNAexpressionalterationsinextracellularvesiclesisolatedfrommurineheartpostischemia/reperfusioninjury
鼠心脏缺血/再灌注损伤后细胞外囊泡中环状RNA表达的变化
期刊：nt.J.Cardiol.（IF=3.）
发表单位：同济大学医学院
导读
该项研究主要探究了I/R损伤后心脏circRNA差异表达，文章大体内容如下：（1）使用小鼠模型进行RNA-seq测序鉴定心脏cEVs中的circARs，筛选出I/R后差异表达的circRNA；（）对差异表达的circRNA进行功能富集分析，并构建circRNA-miRNA互作网络，预测差异表达的circRNA的功能；（3）qPCR验证circRNA的表达差异。文章整体各部分环环相扣，验证过程思路清晰很容易理解。摘要
背景：越来越多的研究表明细胞外小泡（EVs）参与心血管疾病。然而，在缺血/再灌注（I/R）损伤过程中，circRNAs在心脏EVs中的作用尚不清楚。
方法：从I/R损伤的心脏中分离cEVs，并进行RNA序列测定（RNA-seq）以确定circRNA在cEVs中的表达，探讨其在I/R病理过程中的潜在作用。结果：心脏I/R在4小时内显著增加了EVs在心脏中的释放，cEVs的RNA序列识别出个显著差异表达（DE）的circRNAs，其中I/R组有个下调，66个上调。GO和途径分析表明，这些DE-circRNAs与蛋白结合和激酶激活活性有关，主要参与代谢过程。circRNA-miRNA分析显示了DE-circRNA通过作用于miRNA而调控靶基因的广泛潜力。
结论：这些发现首次揭示了来源于假心脏和I/R心脏组织的EV中circRNA的具体表达模式，为I/R损伤提供了可能的靶点和途径，为circRNA和EV在心脏I/R病理中的作用提供了重要证据。
前言
心肌缺血/再灌注（I/R）损伤是最常见的心脏疾病之一，可导致心律失常、心肌顿抑和致死性心肌再灌注损伤等病理生理改变。细胞外囊泡（EVs）是一类异质的、纳米尺度的、细胞衍生的膜性囊泡，存在于多种生物膜中。先前的研究证明了EVs在许多生物学功能中的重要作用。
环状RNA（circRNAs）是共价封闭的RNA，具有丰富度、稳定性和进化保守性等特点。越来越多的证据表明circRNAs在包括心肌梗死（MI）和心力衰竭在内的心血管疾病中的意义。我们推测EVs中的circRNAs可能在I/R损伤中起重要作用。本研究旨在从I/R损伤的心脏中鉴定EVs的circRNAs特性，为进一步研究心脏I/R损伤提供新的靶点。
结果
1I/R损伤与EVs在心脏组织中的释放
cEVs的粒径主要在nm左右，典型的外显子标记包括CD63、CD9、Alix和TSG在cEVs中表达。在cEVs中发现颗粒数和总蛋白含量之间存在线性关系。共聚焦成像证实了cEVs向原代心肌细胞和非心肌细胞的转移。我们发现与假手术组相比，缺血再灌注3小时后cEVs含量显著增加，再灌注4小时后cEVs含量仍保持在较高水平。（注：与对照相比，I/R损伤后cEVs含量提高，而cEVs含量与总蛋白含量相关，所以研究重点是cEVs中差异表达的circRNA）
I/R损伤后CEV的差异性circRNA
共识别个显著差异表达（DE）-环RNA。在个DEcircRNAs中，与对照组相比，I/R组有个circRNAs下调，66个circRNAs上调，其中4个是新识别的circRNAs（新circRNAs）。DEcircRNAs主要是个核苷酸（nt）并被识别为外显子circRNAs。（注：对从cEV中提取的circRNA进行差异表达分析）
图假手术组与I/R组cEVs中circRNAs的差异表达。（A）环状RNA簇热图。（B）circRNAs火山图。显著上调和下调的圆圈分别显示为红点和绿点。（C）I/R损伤小鼠和假手术组cEVs中上调和下调circRNAs的数量。确认了4个新的circRNA（浅红色）。（D）基于核酸长度的DE-circRNAs分布。（E）基于circRNA成分的分布。（D-E）的内环呈下调的circRNA，而（D-E）的外环呈下调的circRNA。（F）circRNA的途径分析。（G）由5个选择的circRNA和前5个预测的miRNA靶构建的circRNA-miRNA网络。黄色周期代表circRNA，绿色箭头代表miRNAs。（H）qPCR检测5-DE-circRNA在cEVs中的相对表达。3差异表达circRNAs的预测途径
上调circRNAs的重要相关途径包括EPH-Ephrin信号传导和囊泡的生物发生和出芽。下调circRNAs相关通路为由SMAD/SMAD3/SMAD4组成的异三聚体通过TGFβ受体复合物和内源性固醇调节转录、信号传导。（注：通过KEGG富集分析差异表达的circRNA，预测差异表达的circRNA的功能）
4I/R损伤中circRNAs-miRNA相互作用的网络
CircRNAs可作为miRNA海绵或竞争性内源性RNA（ceRNAs）调节受体细胞基因表达。在本研究中，构建由5个circRNA（包括mmu-circ、mmu-circ、mmucirc、mmu-circ136和mmu-circ）和每个前5个miRNA预测靶点circRNAmiRNA网络。（注：选择差异表达显著的circRNA，预测circRNA与miRNA相互作用关系，挑选每个circRNA对应的5个靶标miRNA，构建circRNA-miRNA互作网络）
circRNA-miRNA-mRNA网络分析是用于预测circRNA功能的常用方法，生因生物提供circRNA-miRNA-mRNA等靶向预测，为识别可能的靶向互作或调控关系提供指导，详情点击“生因生物RNAseq售后7-寻找ceRNA机制构建关系网络”。
5circRNA序列数据的验证
为了确定cEVs中的circRNAs，随机选择了5个circRNAs，包括3个上调和个下调circRNAs，并进行了验证。使用发散引物的RT-qPCR证实了所选择的circRNAs的显著差异。使用发散性引物的PCR只在cDNA样本而不是gDNA样本中产生一个单独的不同条带，这意味着存在反向剪接连接，而不是基因组重排。（注：利用qPCR验证差异表达的circRNA）
讨论
近年来，EVs因其通过转移多种RNA而介导细胞间通讯的功能受到了广泛的
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