廖日晶中国科学院上海临床研究中心
聂爱英高级应用工程师
想必每一个听了上周田教授Topdown讲座的小伙伴们都受益匪浅，很多都跃跃欲试，也想为自己的课题研究增添一道新的亮点，那么这一期我们借着Topdown的东风，再来为大家分享一篇有关组蛋白Middledown分析的文献。
从字面意思就可以知道，Middledown分析是从中间开始往下分析，一种介于Bottom-up和Top-down之间的分析策略，那么一般什么时候会用到middledown呢？当分析蛋白的分子量较大，直接topdown的方法分析完整蛋白可能会受到灵敏度和碎裂效率差等因素的限制；如果使用trypsin将蛋白酶解成小肽，又会有蛋白序列覆盖度过低、丢失蛋白亚型或蛋白后修饰之间crosstalk信息等问题的时候，我们就可以考虑采用Middledown方法。
从本质上来看，Middledown仍然是一种基于肽段的分析方法，只不过它分析的肽段一般分子量都在Da以上。首先根据蛋白氨基酸序列的特征选取合适的酶对蛋白进行酶解产生一些长肽段，然后再用LC-MS对这些长肽段进行分析。虽然Middle-down方法的整个实验流程看起来并不复杂，但是实际运用时常面临着技术上三个方面的挑战：
1．如何对长肽段进行有效的色谱分离；
2．如何提升长肽段的质谱信号强度；
3．如何提高长肽段的二级质谱碎裂效率以及序列覆盖度。
近期，中国科学院上海临床研究中心的廖日晶博士课题组发展了一个基于选择性赖氨酸衍生化技术的middle-down分析策略，并运用该策略成功实现了对组蛋白H3N-termini后修饰组合类型的分析。
组蛋白后修饰的功能研究是近几十年来表观遗传学研究的一个重要内容，其重要性我们在此不必赘述。H3是组蛋白家族中后修饰位点最多、含量最丰富、变化最多的一个成员，因此它的分析也较其他组蛋白要困难许多。用Glu-C酶解组蛋白H3，将产生一条包含H3氮端前50个氨基酸（1-50a.a.）的长肽段，该肽段包含了绝大多数的H3翻译后修饰位点，且分析难度较之完整的组蛋白要小许多，因此非常适合用于观察研究组蛋白的后修饰。
对带有不同后修饰的长肽段进行高效色谱分离是决定整个分析是否成功最重要的一步。之前报道的文献中，一般都是弱阳离子交换亲水色谱分离方法（WCX-HILIC），WCX-HILIC的优点在于它契合了组蛋白肽段极性大的特点，且能够地对具有不同乙酰化修饰的肽段进行高效分离。但是WCX-HILIC并不是实验室常用的色谱，并且需要使用含盐的流动相，不仅降低了分析的灵敏度，操作起来也十分麻烦。因此，作者决心开发一个使用常规反向色谱（RPLC）分离的新方法。基于课题组前期开发的组蛋白N-丙酰化方法，首先对氮端肽段中的N-terminal氨基、无修饰或单甲基化赖氨酸进行选择性丙酰化，从而放大了原本仅有甲基化差异的肽段之间的理化性质差异；并且丙酰化后的肽段具有更好的疏水性，能够适用于反向色谱。实验表明，原先仅有甲基化分布差异的长肽段，在衍生化后仅使用常规的RPLC即可实现基线分离（Fig.1）。
（点击查看大图）
丙酰化不仅提升了histoneH3长肽段的RPLC分离效率，还能提升肽段的质谱信号强度，进而提高分析的灵敏度，可谓是一举两得。天然的histoneH31-50a.a.肽段中含有17个碱性基团，这使得肽段在离子化时带上很多电荷，而电荷密度过大将导致很大的库伦张力，并最终导致ESI时很宽的电荷分布范围（Fig.2a）。如此宽泛的肽段电荷分布将“稀释”原本就不高的质谱信号，导致分析的灵敏度下降。丙酰化可以大幅减少肽段的带电荷基团数以降低库伦张力，从而显著“压缩”肽段的ESI电荷分布范围（Fig.2b）。实验表明，衍生化之后的肽段的最主要价态离子强度较天然肽段提升了十倍。
Fig.2.衍生化有效压缩histoneH31-50a.a.的价态分布范围、提升肽段离子的质谱信号强度；a：衍生前，b：衍生后。
（点击查看大图）
最后，也是最关键的一点，如何实现完全的二级质谱肽段序列覆盖。使用传统的电子转移碎裂（ETD）虽然可以获得相较CID或HCD更高的序列覆盖度，但是仍然不能满足要求，总的来说，肽段的N端和C端的碎裂较好，而肽段中部的碎裂效率不足（Fig.3a）。为此，作者采用最新的“电子转移辅助高能碰撞碎裂（EThcD）”技术，对使用的HCD能量进行优化，提高了肽段中部的碎裂效率（Fig.4a）。在优化ETD反应时间的过程中，他们发现虽然较短的ETD时间就可以获得良好的碎裂效率，但是此时谱图里同时存在大量的高价态离子（≥+3的离子）。这些高价态离子大多是价态降低的前体离子、含有40个以上氨基酸残基的大碎片，它们对鉴定后修饰位点没有意义，但是却可能干扰分析软件对其它重要碎片离子的识别，反而降低了二级质谱的序列覆盖度。提高ETD反应时间可以有效地减少这些高价态离子，但也会使得所需的+1，+2离子强度下降（Fig.4b）。针对这个问题，作者创新性的采用了动态ETD反应时间来应对不同强度的前体离子——较弱的前体离子使用较短的ETD时间，而强度高的前体离子则使用较长的反应时间。通过优化HCD强度、动态ETD反应时间管理，不仅获得了近乎序列全覆盖的二级质谱（Fig.3b），并且扩大了分析的动态范围。
（点击查看大图）
基于在色谱分离、质谱信号强度以及二级质谱碎裂效率方面的出色表现，研究人员分析了携带Ezh2YN突变的人类淋巴癌细胞Karpas-内的histoneH3N端的后修饰组合模式。研究人员从EI1处理以及DMSO处理（对照）的Karpas细胞内分别鉴定了和个不同的histoneH3的后修饰类型，这个鉴定数超过以往其它middle-down方法。并且通过对翻译后修饰肽段的定量分析，证实了EI1处理能显著降低在DMSO处理细胞内超高的H3K27me3。分析结果表明，在karpas-细胞中，大多数的翻译后修饰通常是组合而非单独出现。在诸多种后修饰中，含量最多、变化最丰富的是K9、K27和K36的甲基化修饰，而仅有大约1/3的肽段含有乙酰化修饰，K23是最主要的乙酰化位点。
在整个分析过程中，作者使用的是商品化的C18色谱柱和常规的流动相，鉴定到的翻译后修饰类型为目前的Middle-down分析方法之冠，且样品的需要量仅为此前方法的约十分之一。该Middle-down方法可以较容易地被广大的蛋白质组学实验室采用，不仅可以应用到组蛋白翻译后修饰的分析中，还可以应用到其它类似的长肽段和小蛋白的分析中，而且作者还在EThcD方法的优化中为大家提供了实验思路，希望可以帮助大家更好的应用EThcD碎裂模式，找到常规的bottomup方法丢失的蛋白整体水平上的定性和定量信息。
感兴趣的老师和同学们可以参考原文：J.ProteomeRes.,16,
点
阅读原文了解更多
扫一扫下载订阅号助手，用手机发文章赞赏
转载请注明：http://www.xiebinbinb.com/blcwemj/4059.html
