今天给大家分享的年6月发表在nature上的一篇文章：Imagingsingleglycans，这是由英国牛津大学化学系的StephanRauschenbach教授、德国斯图加特马普固体研究所的KlausKern教授、PeterH.Seeberger教授一起联合完成的工作。它介绍了通过采用质量选择、软着陆电喷雾离子束沉积进行分离并采用低温扫描隧道显微镜进行成像的技术对单聚糖分子直接成像。
聚糖是由多个单糖通过糖苷键连接形成。其最大特点是：复杂性、多样性和常支化性，因为单糖种类多样，且区别于肽键、核苷键，糖苷键存在立体化学（α与β），此外，由于单糖含有多个烃基，还存在分支异构体。正是由于聚糖的这些特点，其可以携带大量生物信息，参与细胞识别、粘附、分化、免疫识别等过程。特异的聚糖结构可被细胞用来编码若干重要信息。因此，继蛋白质、核酸之后，成为了又一蓬勃发展的研究领域——糖生物学。
目前，聚糖表征往往依赖于质谱法和核磁共振成像的组合，以提供大小，序列，分支和连接信息，因此需要从间接信息中重建结构，直接成像方法还没有实现。因为聚糖复杂性和主链柔性需要单分子方法进行真实空间成像。这篇文献最大的突破就是对单分子聚糖进行了成像。
本篇文章对聚糖进行直接成像采用的技术是扫描隧道显微镜（STM），它能直接观察物质表面的单个原子及其排列状态,并且研究其相关的物理、化学性质。但是，因为可靠的STM实验需要在超高真空（通常为10-10mbar）的受控环境下进行，以减少表面杂质。在此压力下，需要通过分子的升华及其在固体表面的缩合来进行分子被吸附物的制备，以确保化学纯度。但是大分子的蒸气压不高，因此难以用STM直接观测大分子。
解决这个办法的技术是电喷雾离子束沉积（ES-IBD）（图1），这是一种基于电喷雾电离（ESI）的制备质谱方法，可以在超高真空下，在原子控制的环境中，在固态表面上制备单个合成或生物分子。简单来说，这种技术就是先利用电喷雾（ESI）将大分子作为分子离子带入气相，形成离子束，然后通过质量-电荷比(m/z)过滤器对离子束进行质量选择，接着用飞行时间质谱（TOF）对离子束进行监测，将大分子缓慢沉积在超真空的原子清洁的表面。这样就能通过真空手提箱将其转移到STM中直接成像。
图1电喷雾离子束沉积（ES-IBD）技术流程在这篇工作中，首先制备了结构明确的低聚糖，并以带负电荷的聚糖的形式沉积在ES-IBD表面。实验中，选择5eV的低冲击能,保证了软沉积和无破坏沉积，控制Cu（）基板保持在K,STM在4.5K下运行，通过钝化冷表面上的分子扩散来获得表面上的单个分子。最后得到STM图像显示，单分子均匀地分布在表面上并且可以与聚集体区分开，证明ES-IBD具有制备表面上单分子样品的能力。
随后，作者对三种线性聚糖进行了成像，采用的是如图2所示的三种不同结构的化合物(图2b,e,h)。在STM图像中，单个线性聚糖在不同构象上具有相似的长度。低温条件下三种结构的聚糖的单糖分别呈现出5，6，6个特征峰。聚糖中单个单糖的高度在0.15nm和0.25nm之间变化，并且通常通过局部最小值彼此清楚地分开。对于单糖所有的1-6连接，测量峰与峰之间的最大值为0.52±0.07nm，这与其立体化学(α和β)无关联。在分子的一端，烷基胺基连接物显示出一个低高度的特征。由于亚基的形状、大小和间距与二糖的STM成像结果一致。因此，可采用测量的距离作为评价不同糖苷连接的指标。
图2三种线性聚糖的STM图接下来，作者探讨了不同连接的异构体的区分，采用的是如图3a,d所示的两个化合物。前者的STM图像显示出分支清晰的典型结构，后者的STM图像中观察到的更紧凑的形状是其结构灵活性的结果。α1-6连接的距离为0.53±0.05nm，α1-2连接为0.61±0.02nm。3e的STM图像显示了一个足够分散的分子，可以清楚地识别出分支点。可以通过氨基酸连接子识别残基R1，从而确定与整体结构相关的分支点的位置。通过这两个化合物的图谱比较发现，其STM图及距离的测量与化合物的结构呈现出一致的匹配性关系。
图3两种不同连接异构体的STM图然后，作者又将该成像方法应用于更复杂的聚糖(图4a)。其STM图像显示，所有分支彼此分开，每个单糖亚基可见。根据不同的甘露糖单位来区别分支，结合不同的长度(分别为0.82nm和0.53nm)，确定二糖的分支。在中心，也就是三个分支点的位置，分子似乎有一个更大的高度。与其它特征相比，该区域的额外突出可归因于三个连接的糖链形成的空间位阻。通过对不同结构的聚糖的成像分析，成功的实现对不同类型聚糖结构的鉴别，这也表明了该方法的可行性和适应性。
图4复杂聚糖的STM图此外，作者还利用ES-IBD的质量过滤沉积功能，从混合物中提取特定聚糖，且以这种方式沉积的分子的STM成像只显示了与所选择的分子相对应的结构（图5）。
图5混合物中提取的聚糖的STM图总而言之，该研究通过制备质谱和扫描探针显微镜成像的串联方法分离和鉴定生物学相关的聚糖，甚至从混合物中分离和鉴定聚糖，为研究聚糖的拓扑、结构和功能提供了一种直接的、非平均的和化学选择性的方法。在低温条件下，在亚纳米分辨率下直接显示单个聚糖可以防止由于构象平均而造成的信息损失。质量过滤沉积确保观察到的几何和拓扑可以明确地与结构特征相关，如分支和连接类型。这有可能为鉴定单个分子或重复基序的提供标准。为从单分子水平解析聚糖的分子结构和性质提供新的方法。
转载请注明：http://www.xiebinbinb.com/blcwemj/5376.html
