01样品制备
将LBA与指数期MRSA细胞在37℃培养基中以9.mg/mL的最终浓度（即LBA对N菌株的最小抑制浓度的一半）孵育2小时。对照组采用无LBA培养。每组三个样品平行制备用于蛋白质组学。
采用DDA方法生成SWATH-MS光谱库。ms的测量扫描（MS1），选择强度大于cps的前30个前体离子进行碎片化（MS2），每个ms/ms实验包括ms的碎片离子扫描，总循环时间为3.25s。对于SWATH-MS，但在msMS1扫描后，在32×25a.m.u.隔离窗覆盖到1a.m.u.的质量范围内（循环时间3.25s），执行90msMS2扫描。
PRM，MS1扫描的质量分辨率为，而MS/MS为00。首先在DDA模式下进行MS数据采集，以获得30个最丰富的前体离子（每MS/MS50ms）的MS/MS光谱，在每个周期（ms）的每个测量MS1扫描后，周期时间为1.8s。PRM采集包括一个MS1扫描（ms）和一个周期时间在1.3到3.3s之间的目标MS/MS扫描。
02结果讨论
超微结构观察：用扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）观察LBA处理前后MRSA细胞超微结构的变化。通过扫描电镜和透射电镜观察，未处理的细胞显示正常、独立和均匀的细胞质（图1A和1D），而在1/2×MIC（9.mg/mL）下与LBA孵育2小时的细胞因细胞质变薄、聚集和粘附而不规则皱褶。在1×MIC（18.75mg/mL）下与LBA孵育2小时的MRSA细胞被极薄的细胞质扭曲，细胞内物质渗漏，细胞壁消失，细胞膜破裂。此外，在处理过的细胞的TEM图像中观察到的致密颗粒或紧密凝聚的物质被认为是浓缩DNA和异常蛋白沉淀的结果。推测LBA不仅可能对细菌的细胞壁和细胞膜造成损伤，而且还可能影响细胞内蛋白质和DNA。蛋白质鉴定与SWATH定量：采用SWATH-MS研究了LBA处理对MRSA细胞蛋白质组的影响。使用三个对照细胞，三个LBA处理细胞混合样生成参考库。用SWATH2.0软件对6个样本分析，量化两组六个样本的相对蛋白质浓度。共鉴定出个蛋白质和个独特肽。差异表达蛋白的分析：使用0.83≤foldchange≤1.2，个蛋白中有个表现出显著不同的表达模式（P≤0.05），发现28个上调蛋白和72个下调蛋白。使用Uniprot分析DEP功能，并将其分为几个类别，包括蛋白质生物合成（10%）、细胞表面蛋白和毒力因子（8%）等。用CELLOv2.5预测各DEP的亚细胞定位。在个DEP中，81个位于细胞质中，13个位于细胞外空间，6个位于细胞膜中。分别对氧化应激与DNA修复相关、糖和氨基酸转运与代谢相关、与核苷酸合成和辅酶合成及转运有关、蛋白质生物合成相关、细胞壁生物合成相关的DEPs与其他过程相关的DEPs分别讨论，讨论在每个过程中上调下调的蛋白质功能和参与机制。例如氧化应激与DNA修复相关的DEPs分析中说明，氧化应激是活性氧（ROS）水平升高与内源性抗氧化机制活性降低之间的不平衡。参与氧化应激反应的烷基氢过氧化物还原酶亚基AhpC和AhpF蛋白质在LBA处理下表达上调，而有机抗氢过氧化物蛋白样（Ohr）、肽甲硫氨酸亚砜还原酶（MsrB）和4,4′-二苯妥英去饱和酶（CrtN）表达下调。RuvB的下调、UvrA和质粒重组酶的显著下调以及LBA处理后MutS的上调均表明LBA阻断了DNA修复途径，导致MRSA基因组不稳定，导致细胞损伤或死亡。（图为LBA处理后MRSA转录物的相对表达水平）DEPs的蛋白质-蛋白质相互作用网络：每个节点代表一种蛋白质，每个边代表一种相互作用。该网络包含87个边和68个节点，包括97个差异表达蛋白和87个相互作用蛋白。通过将受影响的蛋白质定位到中枢途径，发现暴露于LBA的MRSA细胞在不同代谢途径中的蛋白质连接数量发生了改变。PheT参与转录和翻译过程，与10个相邻的蛋白质相互作用程度最高。参与蛋白质折叠过程的伴侣蛋白DnaK和参与氧化应激过程的AhpC有9个蛋白质相邻，而其他DEPs有8个蛋白质相邻或更少。PheT与DnaK、GroEL、ArgH、ArgG和PurL的相互作用关系表明，参与翻译过程的蛋白质可能触发蛋白质折叠和降解系统，影响核苷酸合成途径。此外，AhpC与DnaK、GroEL、OdhB、GpmA和GapA2的相互作用关系表明，参与氧化应激反应的蛋白质也可能触发蛋白质折叠和降解系统，抑制碳水化合物代谢途径。PRM和qRT-PCR技术对选择DEPs的验证：考虑到对照组和LBA处理组之间的DEPs涉及多个功能类别，选择了11个涉及转录和翻译、细胞壁生物合成等蛋白质作为靶蛋白和基因进行PRM和qRT-PCR分析，测定其蛋白和mRNA水平，以验证SWATH定量结果的真实性和准确性。与SWATH定量结果相比，PRM测定的所有靶蛋白表达水平变化趋势一致。经qRT-PCR检测的靶蛋白中，8个基因的mRNA表达水平与相应的蛋白表达水平呈一致趋势，其余3个基因与相应的蛋白表达水平呈不一致趋势，这可能是由这些基因的转录后调控引起的。[文献来源：Label-freequantitativeproteomicsrevealsthemultitargetedantibacterialmechanismsoflactobionicacidagainstmethicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA)usingSWATH-MStechnology,J.Agric.FoodChem.,67,44,-].预览时标签不可点转载请注明：http://www.xiebinbinb.com/blcwejj/5563.html
