新冠病毒的快速鉴定方法
前段时间浏览SARS-CoV-2相关相关新闻的时候有一条令我很感兴趣：张峰教授团队公布了一种用CRISPR-Cas13技术快速检测新冠病毒RNA的protocol。这种方法在理论上只需要简单3步，一小时内就能得到检测结果。相对于主流检测病毒RNA的qPCR方法来说，这种方法能够大大简化操作流程，降低设备要求，提高检测的效率。（目前尚未用于临床诊断）
AprotocolfordetectionofCOVID-19usingCRISPRdiagnostics.
具体步骤如下：
步骤（1）使用市售重组酶聚合酶扩增（RPA）试剂盒，通过常规的同温扩增技术对提取的核酸样品进行扩增（孵育25分钟）；
步骤（2）将扩增后的样品中加入Cas13蛋白和两种sgRNA的复合物，起报告作用的特殊RNA分子。检测预扩增病毒RNA序列（孵育30分钟）;
步骤（3）用试纸检测（2）中获得的样品（孵育2分钟），肉眼观测检测结果。
经查资料可知，这项技术最早可以追溯到早在年张峰教授团队在《SCIENCEReport》上发表的SHERLOCK技术，该技术的全称为“SpecificHighsensitivityEnzymeReporterunLOCKing”。主要利用的是Cas13蛋白和两种能够特异性识别病毒基因的（S和Orf1ab）sgRNA结合形成的复合体。在检测样本的过程中，只要sgRNA识别并结合病毒的RNA后，就会激活Cas13对其的切割。为了方便对这个过程的鉴定，还要添加一种通过RNA连接的特殊分子，它也会在识别到病毒基因之后被Cas蛋白切割。而试纸能够与被切割和未被切割的RNA分别特异性结合，并且在不同位置显示出条带。这样，就可以直观地确认样品中是否含有病毒的基因了。
protocol中的鉴定示意图，左右分别为含有病毒的不同RNA片段的条带以及对照组条带
读完这篇protocol之后，让我回想起了去年读过的刘耀光教授发表在发表在《华南农业大学学报》的一篇综述，内容有关CRISPR/Cas系统在植物基因组编辑技术中的应用进展，但其中主要介绍的是CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a系统，那么这种能够鉴定RNA病毒基因的Cas13蛋白又是一种怎样的效应蛋白呢？它的特殊性又体现在哪些方面呢？
CRISPR-Cas13a的研究早在年就在一篇发表在Science上的题为“NucleicAciddetectionwithCRISPR-Cas13a/C2c2”的文章中最早提出。近期也有一篇发表在生物技术通报上的综述对基于CRISPR-Cas13a家族的RNA编辑系统的最进展进行了总结。
Cas13是IV型CRISPR酶，与Cas9的不同在于，Cas13结合并切割RNA。Cas13d酶的平均长度为个氨基酸，比其他Cas13酶小20%，比Cas9更是小33%。在向导RNA的引导下，它能够敲低RNA而不改变基因组。这种特性使Cas13有望成为潜在治疗剂，在不永久改变基因组序列的情况下影响基因表达。
我对其中的重点部分进行了阅读和总结，笔记整理如下：
那么在了解了CRISPR-Cas13a系统的分类、作用机制、应用以及问题分析之后，我又看了一篇纽约基因组中心和纽约大学生物信息学专业的Hans-HermannWessels及其团队发表在《NatureBiotechnology》上的，题为“MassivelyparallelCas13ScreensealprinciplesforguideRNAdesign”的论文。研究者设计出一个靶向RNA的新型CRISPR筛选技术，开发了一个计算模型来识别最优的gRNAs，并通过测试条针对48个内源性基因mRNA的gRNAs的活性确认设计得到的gRNAs的可用性，能够在RNA水平上对人类细胞进行大规模的遗传筛选，从而有助于确定非编码RNA的功能。他们证明Cas13可以用于正向转录组整合筛选，并设计了人类基因组中所有蛋白编码转录本的优化Cas13gRNAs。
现在看来，基于RNA碱基编辑系统展现出很好的应用前景，但是如何将大蛋白送到特定组织、体内脱靶点突变的潜在生物学后果仍需要开展进一步的研究。总的来说，CRISPR-Cas13有非永久性调控和分子量小的优势，所以在编辑RNA时效果较好，能够满足一些代谢、免疫疾病中对基因表达蛋白功能进行阶段性调控的需求。
参考文献
1.Zhang,F.,Abudayyeh,O.O.Gootenberg,J.S.AprotocolfordetectionofCOVID-19usingCRISPRdiagnostics.8.
2.Ming,M.etal.CRISPR–Cas12benablesefficientplantgenomeengineering.Nat.Plants6,–(0).
3.Wessels,H.-H.etal.MassivelyparallelCas13screensrevealprinciplesforguideRNAdesign.NatBiotechnol(0)doi:10./s---9.
4.Gootenberg,J.S.etal.NucleicaciddetectionwithCRISPR-Cas13a/C2c2.Science,–().
5.陈敏洁,唐桂月,洪香娜,郝沛,江静,李轩.基于CRISPR-Cas13家族的RNA编辑系统及其最新进展[J/OL].生物技术通报:1-8[0-03-21].
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