第一作者：YiYuan
通讯作者：JianWang,FanJiang,ZhuoTang
通讯单位：中国科学院成都生物研究所天然产物研究中心；成都中医药大学；北京大学深圳研究生院
研究要点：
1.揭示了核黄素对存在G-T错配的DNA双链光致断裂过程并证明了肿瘤细胞中G-T错配是核黄素在光照下引起细胞损伤的靶点。
2.探究了核黄素对存在G-T错配的DNA双链光致断裂作用的内在机制。
研究背景：
光动力治疗是一种依靠光敏剂、光能和氧气对肿瘤进行破坏，在临床上已广泛应用的一种治疗方法。目前最广泛的光敏剂是卟啉类化合物，其具有较高的光动力效率以及较长的波长吸收等特点。核黄素存在于所有的有氧细胞，参与多种黄素蛋白酶的氧化还原过程，是最有效的天然光敏剂之一，也是研究最广泛的光稳定性化合物之一[1]。但是进一步应用受到了不清晰作用机制的限制。此前，Barton等人研究了用钌络合物作为光敏剂来发生DNA和RNA的光致断裂，其主要导致了鸟嘌呤氧化。他们还利用了铑金属化合物来靶向DNA错配位点导致位点特异性光致断裂。这是一种利用抑制错配修复（MMR）缺陷细胞增殖的靶向治疗方法。哺乳动物细胞DNA中最丰富的修饰碱基是5-甲基胞嘧啶，占所有胞嘧啶残基的2-8%。5-甲基胞嘧啶可自发脱氨生成胸腺嘧啶，在DNA双链中会产生高频率的G-T错配。据报道，大约18%的实体瘤和10%的白血病患者失去了DNA错配修复的功能。缺失MMR系统就无法修复复制错误，使得整个基因组中的错配突变持续存在。由于MMR缺陷细胞的自发突变率增加了-0倍，因此在肿瘤细胞的基因组很可能包含大量的G-T错配。本文即报道了在核黄素存在的情况下，光照可以选择性地诱导错配修复系统缺陷的肿瘤细胞死亡，这不仅解释了以往报道的用核黄素作为光敏剂进行细胞实验的结果，同时也强调了G-T错配可作为肿瘤细胞潜在的药物靶点。要点1.揭示了核黄素对存在G-T错配的DNA双链光致断裂过程并证明了肿瘤细胞中G-T错配是核黄素在光照下引起细胞损伤的靶点
在该工作之前，该课题组报道了核黄素可通过DNA/RNA双链中的G-U摇摆来实现目标RNA序列特异性光致断裂[2]。因此作者猜测在DNA双链中的G-T错配也能成为核黄素靶点产生光致断裂。该工作以含有第14个核苷酸G-T错配的双链DNA（D-t/D-g）作为核黄素光致断裂的靶点，以32P同位素标记了D-t链的左端（图1A）。DNA链在pH=7.5的磷酸盐缓冲液中加入M核黄素培养。在用45W家用灯照射1h后，将反应混合物在90℃下加热30min，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行物质分析。发现双链DNA需要在光照和核黄素存在的条件下才可产生D-t/D-g光致断裂，且D-t链可断成Lp，而D-g链保持完整（图1B）。光致断裂产生的Lp链在电泳实验中位于第13和14个核苷酸之间，Lp的迁移率高于14nt标记物（图1C），由此可确定光致断裂的切除位点为双链DNA中G-T错配对的胸苷下游的胞嘧啶。通过其他实验还发现了：1）光致断裂效果与核黄素浓度有关；2）G-T错配相邻的碱基可以是任意的；3）在16种错配中，只有G-T和G-A可以导致断裂，且G-T的效率更高；4）相比于其他的光致断裂试剂会存在一定的随意切割，核黄素导致的光致断裂具有较高程度的位点选择性；5）对于反应条件进行筛选：pH=7.5时光致断裂效果最好，Na+和K+对光致断裂影响不大，Mg2+随着浓度增大会一定程度上降低光致断裂。6）光致断裂速率比人工DNA选择性切割位点要高得多，并与通过体外选择获得的DNA切割酶相当。图1a）核黄素在光照下产生的DNA双链光致断裂示意图；b）D-t/D-g双链光致断裂的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；c）裂解片段Lp的分析。
为了探索核黄素导致DNA链光致断裂的详细机理，作者在有氧和无氧条件下进行核黄素诱导的DNA光致断裂，发现与有氧环境相比，在缺氧条件下，切割效率降低了60%（图2）。这一结果表明，激发的光敏剂能与基态氧相互作用产生活性氧，从而引发DNA氧化裂解。此外，作者发现羟基自由基清除剂（DMSO、tBuOH）、超氧化物清除剂（超氧化物歧化酶、SOD）或过氧化氢清除剂（过氧化氢酶）的加入不影响裂解活性，而单线态氧猝灭剂（NaN3和DABCO）则完全抑制了裂解活性，表明光致断裂的产生是通过单线态氧形成的机制进行的（图3）。图2在有氧和无氧条件下的光致断裂反应
图3探究ROS清除剂在光致断裂反应中的作用
为了验证在核黄素存在下，肿瘤细胞可通过在基因组G–T错配导致DNA单链断裂来诱导细胞死亡，作者对比了MMR缺失型和MMR型HCT细胞死亡率差异。通过瞬时转染含有hMLH1野生型基因的载体（pcDNA3.1）获得具有MMR功能的HCT，由于hMLH1蛋白的有效表达，该载体具有MMR功能。作为对照，MMR缺陷型HCT细胞是错配修复不全的，转染空载体（图4A）。在相同浓度的光照条件下，用alamarBlue比色法测定一系列不同核黄素浓度下两种细胞的细胞存活率。如图4C所示，随着核黄素浓度的增加，两种细胞的光毒性显著增加。然而，当核黄素浓度从0增加到M时，MMR型HCT细胞的细胞存活率明显高于MMR缺失型HCT细胞。一旦核黄素浓度高于M，光照下对两种细胞都有致死作用。当培养液中核黄素浓度为50M时，MMR型和MMR缺失型HCT细胞的相对细胞死亡率达到1.6倍（图4D）。这些数据表明，在适量的核黄素存在下，错配修复缺陷的肿瘤细胞具有较高的凋亡率，因此DNA错配水平的增加可能是核黄素在光照下引起更多DNA损伤的靶点。图4a）光照射MMR型和MMR缺失型HCT细胞；b）两种类型HCT细胞hMLH1蛋白表达的SDS-PAGE分析；c）不同浓度核黄素照射下两种类型HCT细胞的细胞活性分析；d）根据图C的数据进行的相对细胞死亡分析。
要点2.探究了核黄素对存在G-T错配的DNA双链光致断裂作用的内在机制
实验证实，核黄素在光照下可以通过形成单线态氧的氧化机制在G–T错配处有效地产生单链断裂，但单线态氧的寿命太短，不足以使它们达到G–T错配并导致DNA损伤。作者还在没有核黄素的情况下，用NaClO和H2O2进行裂解反应生成单线态氧，但仍未检测到DNA链断裂。提高单线态氧浓度或用D2O作为溶剂延长单线态氧的寿命都不能提高效率。因此，作者推测核黄素可能首先识别G–T碱基对，然后与DNA错配相互作用，通过产生单重态氧，有效地切除相邻核苷酸，从而触发光致断裂。作者根据之前报道的含有脱嘌呤/脱嘧啶位点（AP位点）的双链DNA可以作为核黄素识别的结合位点[3]以及对G-T摆动的自发翻转的研究，假设双链G-T错配的一个核苷会从DNA螺旋中翻转出来，形成一个类似核黄素结合AP位点的结构。作者将双链D-t/D-g的G-T错配中的每个核苷替换到AP位点，得到两个新的双链DNA（D-t-AP/D-g和D-t/D-g-AP），分别用于裂解反应，发现鸟嘌呤与核黄素的相互作用至关重要（图5A）。作者对核黄素复合物中D-t/D-g双链进行了分子动力学模拟，发现胸腺嘧啶在G-T错配中确实有部分翻转（图5B），形成一个能使核黄素结合的位点。核黄素与鸟嘌呤形成三个氢键，另外核黄素的异四氧嘧啶核与上下游碱基形成了π-π堆叠，稳定了这种结合形式（图5C）。胸腺嘧啶不是完全翻转出来的，而是与核黄素形成的π-π堆叠和氢键堆积在将被切割的下游碱基上（胞嘧啶），这可以弥补其不利的翻转状态。这些结果表明，核黄素识别双链DNA靶点的G-T错配，产生了与错配位点的特异性空间构型，解释了该方法的特异性和较好的切割效率。图5a）分别将G-T错配的两个核苷替换为AP位点所诱发的光致断裂；b）核黄素插入胸腺嘧啶核苷部分翻转后留下的空腔模型；c）核黄素与碱基之间的氢键和堆叠作用的模型示意图。
工作小结：
本工作依据核黄素在光照下能特异性产生G-T错配DNA链的光致断裂的性质，验证了核黄素可识别肿瘤细胞G-T错配靶点并用于肿瘤治疗，清楚地了解如何特异性靶向DNA位点，该工作不仅可以提高了探测DNA的能力，而且可以为开发新的化疗药物提供思路。因此，小分子核黄素被证明能够识别G-T错配，是一种很有前途的药物设计先导化合物。
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