第一作者：JacksonD.Harvey
通讯作者：DanielA.Heller
通讯单位：MemorialSloanKetteringCancerCenter
研究要点：
1.碳纳米管传感器的构建及性能评价；
2.验证碳纳米管传感器检测体液和活体中的miRNA。
研究背景：
体液中的核酸是众多疾病标志物的来源之一，其中，miRNA能在生物体内稳定存在并与多种疾病的发生和发展息息相关[1-2]。因此，对包括miRNA在内的核酸进行检测将有助于疾病早诊和治疗。现目前，PCR和分子微阵列能够实现miRNA体外检测[3-4]，但对体内miRNA的检测和原位实时分析仍然是一个巨大挑战。本篇文章通过核酸杂交的方式，调节碳纳米管表面的水和阴离子电荷的密度，进而改变碳纳米管的光谱信号，实现了体液和体内的miRNA检测。此外，通过实验和分子动力学模拟确认了该传感信号变化，源于由核酸杂交引起的局部碳纳米管表面静电基团和水的密度变化。要点1.碳纳米管传感的构建
如图1a所示，核酸探针包含能与碳纳米管紧密结合的核酸序列（(GT)15）和捕获miRNA的探针序列，传感器由结合核酸序列与碳纳米管紧密结合形成。该传感器在与目标核酸杂交后，其光谱以发生蓝移为主，且不同碳纳米管组建的传感器对目标核酸的输出信号存在差距（图1b），传感过程中的杂交行为被AFM证实（图1c）。此外，通过在探针末端标记荧光团（碳纳米管猝灭荧光）也验证了传感器的杂交过程（图1d和1e）。众所周知，碳纳米管表面的水密度和阴离子电荷密度降低，均会导致光谱蓝移。作者通过分子动力学模拟杂交前后水和磷酸根密度变化，结果表明磷酸根密度降低（图1g），而水的密度增加（图1f），表明传感信号蓝移动源于碳纳米管表面的磷酸根密度降低。此外，作者认为利用两性小分子聚集在新暴露（杂交后）的纳米管表面，将有助于增加传感的响应强度。实验结果表明体系中添加十二烷基苯磺酸钠（SDBS）将传感器的光谱蓝移信号提高了10倍左右（图1h和1f），其原理如图1j所示。图1碳纳米管检测miRNA杂交：（a）miRNA传感组装示意图；（b）传感分析目标miRNA/DNA和非目标核酸；（c）AFM对杂交复合物成像；（d）荧光标记分析；（e）分子动态模拟；（f）水的分布；（g）磷酸分布；（h）SDBS对传感的光谱影响；（I）SDBS存在时传感的分析性能；（j）SDBS存在时传感示意图。
要点2.碳纳米管传感器的性能评价
随后，作者针对多种目标miRNA构建了不同碳纳米管传感器，在测定目标miRNA时均有良好的信号响应（图2a）和选择性（图2b）。对不同浓度的目标分析结果表明，该传感对miRNA的检出限在10-pM之间（图2c），并对目标DNA响应速度明显快于目标miRNA（图2d）。此外，作者也讨论了探针的识别区域长度和目标核酸的长度对传感性能的影响。结果表明，识别区域应需要长于10bp且位于探针末端更有利（图2e和2f）；在测定长链目标核酸时，测得的光谱发生了红移（与测定miRNA相反），这可能是目标末端核酸与碳纳米管发生了结合，增加了碳纳米管表面的磷酸密度，而致使光谱红移。该假设在后续实验得到证实（图2i和2j）。在后续研究中，作者也证明了该碳纳米管传感器可用于多组分分析，且信号的变化可通过链置换反应进行动态调控。图2miRNA检测的检出限、动力学和功能：（a）传感对不同miRNA的响应；（b）传感选择性验证；（c）浓度响应曲线；（d）传感对目标DNA和RNA的响应动力学；（e）传感末端杂交和中部杂交示意图；（f）中部传感和末端传感比较；（g）修饰目标传感示意图；（h）传感对长链目标的分析；（i）不同传感设计的光谱预测；（j）设计传感的验证。
要点3.碳纳米管传感器检测体液和活体中miRNA
为了验证碳纳米管传感器在检测miRNA中的实用性，作者首先通过加标的方式成功检测到了尿液和血清中的miRNA。在尿液中该传感对浓度为1-10nM的miRNA有明显响应（图3a和3b）；通过向血清中加入蛋白酶K避免RNA酶的影响，该传感器对血清样品中的miRNA也有相似的灵敏度（图3c）。随后，作者将传感器封装在半渗透膜毛细管中（图3d），并将其通过手术方式植入裸鼠腹腔中，测试其在活体中的传感性能（图3e和3f）。预先通过静脉向小鼠体内注入1nmol的目标DNA，90分钟后可检测到明显的信号响应（图3g）。该传感方法在体外对目标miRNA测定的阈值为10pmol，但因体内对miRNA的有降解原因，测定体内miRNA的检出限明显高于体外实验（图3h）。图3检测体液中和小鼠活体的miRNA：（a）加标分析尿液中miRNA；（b）尿液中信号强度变化；（c）加标分析胎牛血清中miRNA；（d）半渗透膜封装的传感；（e）活体分析示意图；（f）活体分析照片；（g）活体分析结果；（h）不同浓度的活体分析结果。
工作小结：
本文基于核酸杂交引起的碳纳米管表面静电基团和水密度发生变化，而致使碳纳米管光谱发生变化的原理，制作了一种无需标记的光学核酸传感器。该传感器可对体外核酸和活体体内核酸进行定量检测。在传感中国引入肽核酸或锁核酸，有望进一步增加传感器与较短目标核酸的结合能力，提高传感的性能。此外，通过植入数据收集和传输部件，该传感有望制成可穿戴设备。
转载请注明：http://www.xiebinbinb.com/blcwems/5435.html
